Guía docente de Mecanismos y Metodologías de Biología Molecular Aplicada (M78/56/1/1)

• Diferencias funcionales y de relación entre procariotas y eucariotas.
• Integración en células aisladas.
• Señales extracelulares en organismos unicelulares.
• Transducción de señales en organismos pluricelulares.
• Proliferación celular y apoptosis. Proliferación de orgánulos subcelulares.
• Transcripción: Regulación  y técnicas de identificación de sitios de iniciación.
• Ensayos funcionales para análisis de promotores. Identificación y análisis de regiones de control.
• Identificación de proteínas de unión a DNA, factores de transcripción reguladores. Ensamblajes de complejos de transcripción.
• Degradación de RNAs.
• Mecanismos y control de los ciclos de iniciación y elongación. Terminación y reciclado de ribosomas. Antibióticos. Chaperonas.
• Proteasomas y otros mecanismos. Control de la degradación de proteínas.

Se recomienda tener conocimientos básicos de Biología Celular, Biología Molecular.

• Integrar los conocimientos de Biología Molecular en órganos y sistemas funcionales.
• Conocer los aspectos claves de la regulación de los mecanismos moleculares.
• Conocer las influencias de agentes externos sobre el control de los mecanismos moleculares celulares.
• Conocer y saber aplicar la mutación y modificación del material genético.
• Conocer y saber aplicar los conocimientos sobre recambio de proteínas y su degradación controlada.
• Conocer y utilizar adecuadamente técnicas e instrumentación avanzadas de Biología Molecular e ingeniería genética.

1. Tema 1.- Técnicas avanzadas de manipulación de ácidos nucleicos para generar sondas y ADN recombinante. 

• Métodos de purificación, amplificación y clonación de ácidos nucleicos.
• Métodos de alto rendimiento de purificación de ácidos nucleicos, Polimerasas especializadas para la amplificación mediante PCR de fragmentos de DNA.
• Nuevos vectores y técnicas de clonación: RestrictionCloning, Golden GateCloning y Sequence and Ligation Independent Cloning (SLIC).

2. Tema 2.- Métodos de cuantificación de la expresión génica mediante PCR a tiempo real.

• Fundamento y optimización.
• Selección del compuesto fluorescente: compuestos de unión al DNA y sondas fluorescentes.
• Diseño experimental: singleplex o multiplex.
• Selección de fluoróforos y quenchers.
• Diseño y optimización de reacciones con SYBR Green y sondas TaqMan.
• Normalización y Validación de resultados mediante el uso de genes housekeeper, normas MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments).
• Análisis de datos. Cuantificación absoluta.
• Cuantificación relativa: normalización por unidad de masa o respecto a un gen de referencia (métodos 2^(-ΔΔCt), ΔCt y Pfaffl)

3. Tema 3.- Transcripción y Regulación.

• Técnicas de identificación de sitios de iniciación.
• Análisis  de interacciones de proteínas con el ADN o con sus efectores.
• Técnicas básicas de Identificación de sitios de iniciación y análisis de regiones de control de la expresión génica.
• Identificación de proteínas de unión a DNA (factores y reguladores de transcripción).
• Ensamblajes de complejos de transcripción.
• Degradación de RNAs. 
• Ventajas e inconvenientes de las técnicas de Primer Extensión, RPA, digestión con nucleasa S1 y sistemas basados en genes reporteros.

4. Tema 4.- Técnicas de análisis de la vida media de mRNA y proteínas como procesos reguladores de la expresión génica.

• Técnicas de determinación de la vida media del mRNA, uso de genes reporteros y antibióticos específicos.
• Técnicas de marcaje de proteínas en cultivos celulares para el análisis de la vida media de las mismas.

5. Tema 5.- Métodos de estudio de cascadas de señalización implicadas en la regulación de la expresión e integración.

• Métodos de análisis de fosforilación y modificación de proteínas mediante el uso de fosfoanticuerpos y espectrometría de masas.
• Uso de inhibidores específicos para la disección de rutas de señalización.
• Genes reporteros como marcadores de rutas de señalización.
• Métodos de análisis de translocación al núcleo como indicadores de señalización.

6. Tema 6.- Bioinformática.

• Conocer las principales bases de datos bioinformáticas para búsqueda y análisis transcriptómica y proteómica.

1. Práctica 1. Técnicas básicas de cultivo de líneas celulares eucariotas.

• Mantenimiento de las células en cultivo.
• Extracción de RNA total de líneas celulares eucariotas.
• Retrotranscripción del mRNA a cDNA.
• Estudio de  los niveles de expresión del gen TSC22D3 usando la técnica del PCR a tiempo real (qPCR).
• Determinación de la temperatura óptima de hibridación de los oligonucleótidos, elaboración de una recta estándar para el cálculo de la eficiencia de amplificación.
• Realización de las reacciones de amplificación pertinentes.
• Análisis de los datos y discusión de los resultados obtenidos.

2. Práctica 2. Amplificación a partir de DNA genómico de secuencias promotoras.

• Uso de diferentes estrategias de clonación de los fragmentos amplificados .
•  Análisis de los mismos mediante restricción y electroforesis en geles de agarosa convencionales y desnaturalizante en poliacrilamida.

3. Práctica 3. Ensayos funcionales para análisis de promotores mediante genes reporteros.

• Cultivo bacteriano.
• Clonación de DNA recombinante.
• Transformación.
• Selección de clones de interés.
• Determinación de los niveles de expresión promotora mediante la medida de la actividad  Beta galactosidasa.

4. Práctica 4. Estudio de interacción de una proteína con una secuencia promotora.

• Ensayo de EMSA (electrophoretic mobility shift assay).
• Electroforesis en Geles nativos en poliacrilamida.
• Análisis de los resultados.

• Molecular Biology of the Cell. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, David Morgan, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter. (6thed) Garland Science. 2014
• Biotechnology.David Clark, Nanette Pazdernik. (2nded) Academic Cell. Elsevier. 2016
• Molecular Biology. David Clark. Academic Cell. Elsevier. 2010
• Principes of Molecular Biology. Burton Tropp. Jones and Bartlett Learning. 2014
• Molecular Cloning. A laboratory manual. Michael Green and Joseph Sambrook. (4thed) Cold Spring Harbor Press. 2012
• http://onlinelibrary.wiley.com/book/10.1002/0471142727
• Protocols in Molecular Biology. John Walker ed.Humana Press

• Manual De Biotecnología para el Grado de Farmacia. Técnica Avicam.  Fleming. 2022. ISBN: 978-84-19494-06-1
• Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Online Library.

• NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• BIOEDIT: http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html
• BLAST: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Nucleotides/
• GENBANK: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank
• ExPASy: http://expasy.org/
• GENECARDS V3 HUMAN GENES: http://www.genecards.org/
• PROTEIN DATA BANK: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
• OMIM ®: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/
• PUBMED: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
• WATCUT: http://watcut.uwaterloo.ca/watcut/watcut/template.php?act=snp_new
• NEBCUTTER: http://tools.neb.com/NEBcutter2/
• VIRTUAL RIBOSOME: http://www.cbs.dtu.dk/services/VirtualRibosome/
• PRIMER3: http://frodo.wi.mit.edu/primer3/

La evaluación en la convocatoria ordinaria se realizará siguiendo los sistemas de evaluación y calificación se describen en: http://masteres.ugr.es/bioenterprise/pages/info_academica/index

La evaluación en la convocatoria extraordinaria se realizará siguiendo los sistemas http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbankde evaluación y calificación se describen en: http://masteres.ugr.es/bioenterprise/pages/info_academica/index

La evaluación en la  la evaluación única final se realizará siguiendo los sistemas de evaluación y calificación se describen en: http://masteres.ugr.es/bioenterprise/pages/info_academica/index